[제 12강] NGS library preparation (전처리과정)

NGS는 DNA의 염기서열을 알기 위한 분석법으로 1세대 염기서열 분석법인 sanger sequencing에 비해 저렴하고 시간이 단축되는 혁신적인 기술이다.

오늘은 NGS (next generation sequencing) 차세대 염기서열 분석을 하기 위해 전처리 과정을 알아보고자 한다.

DNA, RNA의 보고 싶은 부위(sequencing 하고자 하는)를 보기 위해 NGS 기기에 들어가기 전에 전처리과정이 필요하다.

우리가 보고 싶은 부위를 증폭을 하고, 기기에서 원하는 부위를 인식하기 위해 샘플 바코드를 붙여주는 작업이 필요하다.
이 과정은 sequencing 기기에 들어가기 전 처리 산물을 library라고 하며
이 과정을 library preparation(라이브러리 제작)이라 한다.
라이브러리 전처리과정 중 우리가 보고자 하는 부분을 targeting 하는 방법으로는 1) multiplex PCR (PCR로 원하는 모든 부분을 증폭-amplicon)하는 방법과 2) probe hybridization capture(증폭 전 자성을 띄는 비드로 원하는 핵산만 고른 후 증폭)하는 방법이 있는데 오늘은 후자인 hybridization capture를 알아보고자 한다.

1) 핵산 shearing (fragmentation)
원하는 샘플(티슈, 혈액 등등)에서 추출한 핵산을 NGS에 읽히기 위해 적당한 size로 잘라야 한다.
핵산을 잘라 조각내는 것이므로 fragmentation이라 하고 방법은 물리적인 방법, 화학적인 방법이 있다. 화학적인 방법은 효소(enzyme-nuclease)를 통해 원하는 사이즈로 자르는 방법이다. 물리적인 방법은 핵산이 들어있는 튜브를 물에 담근 후 초음파(ultrasound)를 통해 랜덤으로 원하는 사이즈로 자르는 방법인데 대표적인 기계로 covaries 사의 제품이 있다.  

2) End repair(말단 수리) 및 3’ A tailing
첫 번째 단계에서 핵산의 단면을 잘랐기 때문에 안정적으로 이중나선을 구조하지 않고 있다. 이런 경우 잘려 나간 DNA를 보완하고 안정한 구조로 만들기 위해 처리를 해줘야 한다. DNA의 특성상 5’에는 인산기가 있어야 하고, 3’에는 A-tailing (염기 중 A, adenine base를 부착)해주면서 추후 어댑터(adapter)가 인식하기 쉽게 꼬리를 만들어준다. (adapter 제작 시 A와 상보적으로 붙을 수 있는 T, thymine을 붙여주면 A와 붙게 됨)

3) Adapter ligation(어댑터 부착)
Sequencing 기기에서 넣어준 핵산을 인식할 수 있는 고유 서열을 붙여주는 과정이다. 어댑터 없이 넣는다면 이 샘플이 어디 샘플이고 무슨 샘플인지 길을 잃기 때문에 나중에 분석을 위해 이미 시퀀스 정보를 알고 있는 어댑터를 붙여줘야 한다.
이때 어댑터는 2번 단계에서 3’ A tailing에 잘 붙게 하기 위해 thymine이 붙어 서로 인식하게 제작한다.
Adapter의 대표적인 모양으로 Y형태(Forked 구조)와 U형태(hairpin 구조)가 있다.
<TMI 헤어핀 구조의 경우 서로 이어져 있기 때문에 가운데 RNA 구조인 U, uracil-유라실이 끼워져 있는데, 이를 2중 구조로 끊기 위해 Uracil을 끊을 수 있는 가수분해 효소 처리를 해준다.>

4) Size selection and clean up (크기 선별 및 정제, 워시)
Library 제작과정 중 사용한 다양한 효소와 찌꺼기가 많이 생기게 된다. (남은 adapter, 사용했던 효소, dNTP, primer 조각 등) 이를 정제하지 않고 실험을 이어간다면 우리가 원하는 부분만 깨끗하게 인식하고 증폭하는 것이 어려워진다.
그러기 때문에 우리는 보고자 하는 지역의 사이즈를 알고, 붙여준 adapter의 크기도 알기 때문에 예상 크기 외에는 모두 제거해 주는 과정이 필요하다.

이때 크기 선별을 하는 재료는 magnetic bead 자성을 띄고 있는 비드를 사용한다. (전기영동도 많이 사용하지만 비드에 비해 시간이 오래 걸리고, 핵산의 소실이 크다)

5) Library amplification (라이브러리 증폭)
원하는 사이즈의 핵산만 갖고 세척까지 진행 후 PCR을 통해 핵산 증폭을 진행한다. PCR과정을 진행하면 비특이적(non-specific)으로 붙은 primer나 서로 붙은 primer(dimer) 등을 제거하기 위해 clean-up을 추가로 진행해 준다.

6) Probe hybridization(프로브 교합)
이중 구조인 핵산을 약 95도씨에서 단일가닥으로 만들어 준 후 biotin이 붙은 프루브를 붙여준다. 이 과정을 probe hybridization이라 한다. 프루브를 붙여 다음 단계 streptavidin bead와 결합시켜 원하는 부분만 가져갈 수 있도록 하는 과정이다.

이렇게 보고자 하는 지역만 프라이머를 디자인하여 라이브러리 제작하는 전처리 과정 후 시퀀싱기계에 들어가 시퀀싱을 진행하게 된다.

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