[제 5강]PCR(polymerase chain reaction)이란? DNA의 증폭 (amplification)방법

최근 코로나19로 대중들에게 PCR, PCR검사, DNA증폭이 익숙해졌다. 바이오에서 PCR은 기본 중 기본, 가장 중요한 기술이다. (PCR이 없다면 이만큼 발전도 못했을 것이다~!!)

일반적으로 PCR을 하는 이유는 아주 소량의 DNA를 대량으로 복제하는 기술로 바이오실험(분자생물학적), 질병의 진단검사, 법의학적 분석 등 널리 사용하고 있다.

PCR의 뜻은 polymerase chain reaction 으로
polymerase는 polymer(여러개 연결) + -ase (효소) = 여러개 연결하는 합성 효소 (중합효소)
polymerase라는 효소를 사용하여 chain reaction 연속적으로 반응한다는 뜻이다.


PCR을 진행하기 위해 필요한 재료는
- DNA polymerase : DNA를 합성하는 효소
- primer : 증폭하고자 하는 유전자의 상보적인 조각 DNA (증폭 시작점을 알려줌)
- Thermal cycler (온도를 조절해주는 PCR기계)
- 뉴클레오타이드 dNTP(각 염기들 A,T,G,C=dATP, dTTP, dGTP, dCTP)와 환경을 유지시키는 시약


PCR의 과정은 크게
1) Denaturation
2) Annealing
3) Extension
단계로 이루어진다.

1) Denaturation 변성 단계
DNA는 2중 나선구조로 2줄의 DNA가 서로 상보적인 염기끼리 수소결합으로 결합한 상태이다. DNA를 증폭(복제)하기위해 2중 나선을 끊어 단일 가닥에서 진행되는데 이 과정을 Denaturation이라고 한다.
2중 -> 단일 (double strand (ds) -> single strand (ss))
약 95도씨의 높은 온도에서 수소결합을 끊어준다.

TMI!!!!!!! 여기서 의문이 생길 수 있다!!!!!!
DNA polymerase는 효소, 즉 단백질인데 어떻게 95도씨에서도 변성이 되지 않고 활성을 하는가!이다.
DNA polymerase의 발견은 Thermaceae과에 속한 고온에서 사는 세균에서 찾았다. 이 세균의 합성효소를 기반으로 만들어졌다.

2) Annealing 단계
DNA 염기서열 중 우리가 원하는 지역의 유전자만 증폭을 하게되는데, 이 때 증폭하고자 하는 지역의 시작과 끝지점의 상보적인 DNA 조각인 프라이머 primer가 붙는 단계가 annealing 이다.
일반적으로 primer에 따라 온도가 다르지만 50-65도씨 정도이다.
primer의 염기서열의 구성에 따라 붙는 온도가 달라진다 이 때 필요한 계산식 Tm값

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

primer의 염기의 갯수를 대입하여 계산한다.
primer 구성 중 G,C의 비율이 높다면 Tm값이 높아진다. 또한 Tm값에 비해 너무 낮은 온도로 진행하게 되면 non-specific하게 우리가 원하는 지역이 아닌 무작위하게 붙을 수 있으므로 주의해야 한다. 반대로 너무 높으면 primer가 붙지 않을 수 있다.

3) Extension 합성 단계
약 68-72도씨에서 이루어지며 DNA polymerase 중합효소가 primer자리를 인식하여 합성하기 시작한다. 이때 주형 DNA(template, 증폭하고자 하는 DNA)의 상보적인 염기를 인식하여 dNTP들이 와 붙으면서 합성(연장)하게 된다.

이런 1)-3)까지의 사이클을 여러번(20-40번) 진행하게 되면 약 2의 n제곱(n=사이클수, 지수함수로 증폭)의 양이 증폭하게된다.  

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감사합니다🫶